Receptores nicotínicos : interacción con el entorno lipídico y aspectos que regulan su expresión heteróloga - Aztiria, Eugenio Manuel.; Barrantes, Francisco J., 1944-; Alonso, Telma Susana. (1998)
Este trabajo de tesis se ha dividido en dos partes para un mejor desarrollo de los temas abordados. La primera, comprende el estudio de la relación entre una proteína intrínseca de membrana -el receptor nicotínico de la unión neuromuscular- y los lípidos de su entorno. En la segunda parte, se evaluó la capacidad de distintos sistemas celulares hospedadores para expresar en forma heteróloga receptores homoméricos constituidos por la subunidad de alfa7 del receptor nicotínico neuronal. En la primera parte, se analizó la influencia del estado físico de la membrana sobre la funcionalidad del receptor. Con esta finalidad se determinaron los requerimientos energéticos de los procesos de conductancia de iones y de cierre del canal del receptor, tanto en la forma fetal (alfa2ßgamma delta) como en la adulta (alfa2ßepsilon delta), expresadas en diferentes ambientes lipídicos. Se emplearon tres líneas celulares diferentes: BC3H-1 provenientes de un tumor intracraneal de ratón que expresa endógenamente el gama-AChR y dos líneas derivadas de células de ovario de hamster (CHO) que expresan en forma heteróloga el gama-AChR(CHO-AR42) o el epsilon-AChR(CHO-K1/A5). En el caso del proceso de conductancia, se determinó un valor para el coeficiente de temperatura (Q 10) de 1,2 a 1,3 y una energía de activación (Ea) entre 3,5 y 4,5 kcal/mol, según el ambiente lipídico en el que la proteína se encuentre. Los valores determinados para este proceso son semejantes al reportado para la sensibilidad térmica de los iones en solución, indicando que la translocación iónica a través del canal de AChR se produciría en todos los casos, en forma pasiva. Los requerimientos energéticos del proceso de cierre del canal en los tres ambientes lipídicos son semejantes, alcanzando un valor de Ea de alrededor de 13 kcal/mol. Las transformaciones de Arrhenius realizadas para los procesos de conductancia y de cierre del canal del AChR exhiben un comportamiento lineal sugiriendo que dentro del rango de temperaturas de 5°C a 35°C no se producen transiciones de fase en la porción lipídica. Por otra parte, el estudio de los requerimientos energéticos del AChR sugiere que un mismo tipo de receptor (gama-AChR) expresado en dos ambientes membranáceos distintos (células BC3H-1 y CHO-AR42) exhibe propiedades diferentes, sugiriendo que el ambiente lipídico que rodea a la proteína impone un efecto modulatorio sutil sobre el canal del AChR. Con la finalidad de estudiar relaciones puntuales entre AChR y los lípidos de la membrana que lo rodean, se analizó el comportamiento del canal del receptor en un ambiente depletado en el nivel de esfingomielina. Se utilizaron células CHO como sistema de expresión para el epsilon-AChR. Específicamente, se empleó un clon denominado CHO/SPB-1, derivado de las células CHO-K1, que presenta alteraciones en la biosíntesis de esfingolípidos originadas en una mutación del gen que codifica para la enzima serinapalmitoiltransferasa (SPT) que la hace sensible a la temperatura. La funcionalidad del canal del receptor se estudió bajo condiciones de permisividad, semipermisividad y no permisividad de la actividad de la SPT. La disminución de los niveles de esfingomielina en la célula no altera las propiedades funcionales del canal del epsilon-AChR independientemente de los días de cultivo en condiciones no permisivas. En forma complementaria, se estudiaron los parámetros funcionales del receptor expresado en células CHO-K1/A5, derivadas de CHO-K1, que no presentan alteraciones en la síntesis de esfingomielina. Dichas células se sometieron a ayuno lipídico por cultivo en medio definido, carente de lípidos, suplementado con un inhibidor de la enzima ceramida sintetasa. Este tratamiento no produjo modificaciones de los parámetros funcionales estudiados en el epsilon-AChR, en concordancia con los resultados obtenidos en las células de metabolismo lipídico alterado. Ambas estrategias experimentales indican que la variación de los niveles celulares de esfingolípidos no afectaría la funcionalidad del AChR. Hasta el presente, y debido a su abundancia, el miembro de la familia de receptores nicotínicos más estudiado ha sido el de órgano eléctrico de rayas y anguilas. La utilización de un sistema que exprese con altos rendimientos a otro miembro de la familia puede permitir una caracterización similar. La estrecha relación filogenética, así como la presencia de regiones altamente conservadas entre el AChR de órgano eléctrico y el de sistema nervioso central de los vertebrados superiores, alfa7 (alfa7-AChR), constituyeron precedentes decisivos en la elección de este último como modelo de estudio. El objetivo de la segunda parte de esta tesis fue analizar la capacidad de diferentes sistemas hospedadores para expresar alfa7-AChR a nivel transcripcional y traduccional. No todos los sistemas de expresión parecen ser capaces de expresar este receptor neural, aunque todavía no se ha podido determinar el paso en el que se interrumpe su expresión funcional. Recientemente se ha propuesto que las células de origen neural estarían mejor capacitadas para expresar este receptor nicotínico. Para abordar los objetivos planteados se emplearon cuatro sistemas celulares, dos de los cuales derivan embriológicamente de cresta neural (células PC12, provenientes de un tumor adrenal de rata y células GH3 de tumor hipofisario) y dos líneas celulares provenientes de otras regiones embrionarias (fibroblastos de ratón suizo NIH-3T3 y células de insecto Sf9).// CALIFICACION DEPARTAMENTO DE GRADUADOS Calificación de la defensa oral:Sobresaliente - 10(diez) Fecha:3/6/99