Mecanismo de acción del ácido abscísico : caracterización parcial de los sitios de unión del ABA asociados a membrana - Curvetto, Néstor Raúl. (1985)
Se informa el hallazgo de sitios de unión para ácido abscísico sobre la superficie de los protoplastos de células estomáticas de Vicia faba L. mediante cromatografía de afinidad celular con Sepharose-6B-espaciador-(±)cis, trans ABA. La magnitud de la interacción fue evaluada usando una técnica en semi- microrecipiente, hematocritos Wintrobe, donde las perlas de Sepharose fueron suavemente agitadas de manera que estuvieran en íntimo contacto con una suspensión de protoplastos de células estomáticas en manitol 0,6 M, pH 5. La proporción de protoplastos de células estomáticas a perlas de Sepharose indicó una interacción tres veces superior de los protoplastos con Sepharose 6B-espaciador-(±)cis, trans ABA en relación al control Sepharose 6B-espaciador. Por medio de una técnica desarrollada aquí, la aglutinación de cloroplastos con suero de conejo anti-ABA, se pudo obtener una evidencia indirecta de sitios de unión sobre la envoltura de cloroplastos de células de mesófilo de Vicia faba L. Los cloroplastos intactos aislados recientemente dieron una aglutinación positiva pocos minutos después de realizar la mezcla de la suspensión de cloroplastos con la dilución del anticuerpo. La participación de anticuerpo en tal aglutinación fue confirmada a través de su marcación con inmunoglobulina de oveja anti-conejo marcada con isotiocianato de fluoresceína. Se utilizó una técnica de inmunofluorescencia indirecta para localizar ABA endógeno en tejido epidérmico de V. faba. Se utilizó tejido epidérmico cepillado y sonicado, de hojas controles y provenientes de un tratamiento de déficit hídrico. El isotiocianato de fluoresceína (ITCF) conjugado a inmunoglobulina de oveja anti- conejo se utilizó para marcar la epidermis previamente incubada con anticuerpo de conejo anti-(±)cis, trans ABA. Las tiras epidérmicas sonicadas se encontraron adecuadas para este trabajo. La fluorescencia de ITCF estuvo presente en la epidermis completa del material proveniente de plantas controles y plantas sometidas a estrés hídrico. La fluorescencia en las células estomáticas en un caso y otro fue ligeramente superior que en la epidermis remanente, siendo marcadamente superior la fluorescencia asociada a estomas de plantas sometidas a estrés hídrico. Por otra parte, la técnica mencionada se utilizó con la finalidad de detectar el efecto de prolina suministrada a hojas jóvenes de V. faba, sobre el nivel de ABA epidérmico y sobre la aglutinación de cloroplastos. Después de 1 h de tratamiento con prolina 5 mM, el procedimiento de marcación con ITCF para ABA sobre tiras epidérmicas sonicadas mostró un incremento del ABA endógeno y el título de aglutinación de cloroplastos fue 16 veces superior que aquel del tratamiento control, agua 1 h. Los cloroplastos correspondientes a este control no aglutinaron con diluciones del suero anti-ABA. La incubación "in vitro" de cloroplastos aislados con prolina 5 mM dio el mismo título que los controles, dentro de la primera hora posterior al aislamiento. En un experimento simultáneo sobre el mismo material vegetal, se estudió el efecto de ABA 10-7 M sobre la marcación con ITCF. //