Estudios estructurales de células y moléculas informacionales - Pietrasanta, Lía I. (1996)
El receptor de acetilcolina (AChR) es el paradigma de las moléculas informacionales gatilladas por ligando. Desde el punto de vista estructural el AChR es una glicoproteína intrínseca de membrana, rodeada de un anillo lipídico, cuya presencia es esencial para su función. En la parte A de esta tesis se describen los estudios espectroscópicos destinado a dilucidar la topografía de las clases mayoritarias de fosfolípidos, es decir de fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE), en membranas ricas en el receptor de acetilcolina obtenidas del órgano eléctrico de Torpedo marmorata. Esto implica la descripción de la distribución a través de la bicapa, así como su relación estructural con la proteína receptora. Se utilizaron derivados lipídicos fluorescentes, lo cuales se adicionaron a membranas nativas o a suspensiones de liposomas por inyección de una solución etanólica de la sonda. La extinción de la fluorescencia de las fosfatidilcolinas marcadas con el grupo NBD(7-nitrobenz-2oxa-1, 3-diazol-4-ilo) y de los glicerofosfolípidos de etanolamina marcados con N-rodamina (N-Rho) o NBC fue medida en membranas modelo preparadas de tal forma que se ubicasen selectivamente en una de las hemicapas (externa o interna), y los resultados fueron comparados con los obtenidos para membranas nativas en AChR. Los datos obtenidos por la extinción de la fluorescencia empleando ión cobalto o ácido trinitrobencenosulfónico, las mediciones de vida media de fluorescencia y de polarización de la fluorescencia en membranas nativas ricas en receptor de acetilcolina y en sistemas modelo, perimitirían concluir que los derivados de PE marcados con N-Rho o NBD están localizados en la interfase lípido-agua, parcialmente expuestos al medio acuoso. En el caso de los análogos fosfolipídicos de PC, el fluoróforo (NBD) se reacomoda cerca de la misma interfase, mientras que los derivados N-Rho-PE y NBD-PC están localizados en la hoja externa de la bicapa lipídica. La parte B de la tesis está dedicada a la combinación de diferentes técnicas de microscopía en estudios estructurales de células y moléculas informacionales. En el capítulo II se presenta una introducción general al campo de la microscopía de fuerza atómica, los diferentes modos de operación del microscopio, las fuerzas involucradas en las mediciones y la preparación de las muestras. En el capítulo III se describe el uso de la microscopía de fuerza atómica (SFM) para visualizar las estructuras subcelulares de células cultivadas, deshidratadas y secadas al aire, provenientes de una línea celular derivada de un adenocarcinoma de glándula mamaria de rata (RMCD). La identificación de las subestructuras se realizó por inmunofluorescencia y sondas fluorescentes específicas. Las células fueron crecidas adheridas al soporte de vidrio, presentando en estado seco un espesor en el rango de los submicrómetros. Dentro del dominio nuclear los nucléolos aparecen como protusiones cónicas. Las extensiones de membrana, microespículas y microvellosidades no sufrieron alteracionas por la fijación con glutaraldehído y el secado al aire y, aparecieron como elementos aislados o comunicaciones intercelulares. Cuando la membrana plasmática y las proteínas solubles fueron selectivamente removidas con un detergente no iónico en un sistema tamponado, las mitocondrias se concentraron primariamente en el espacio perinuclear y exhibieron una forma filamentosa bien definida. Su identidad fue confirmada por el marcado con la sonda fluorescente específica, rodamina-123. El citoesqueleto presentó una compleja red de manojos de fibras conteniendo actina entrecruzada con filamentos más delgados. Las estructuras fibrosas más pequeñas reveladas con el SFM fueron de -8 a 10 nm en altura y 80 nm en ancho. Un problema central que limitaba la utilización del SFM en sistemas biológicos era la fijación en forma reproducible de las muestras sobre una superficie atómicamente plana como la mica. En el capítulo IV se muestra un método para la visualización rutinaria con el SFM de plásmidos de ADN superenrollados, relajados y linearizados, inmovilizados sobre mica recién clivada a través de la acción tensioactiva del cloruro de bencildimetilalquilamonio (BAC) a concentración micromolar. El rendimiento obtenido es alto y reproducible; las moléculas aparecen bien extendidas y dispersas y el nivel de contaminación es mínimo. La longitud de contorno de las moléculas relajadas y linearizadas visualizadas en aire concuerda bien con el valor por vuelta de hélice (3.4 Å/b p) de ADN-B en solución. Se ha introducido también el uso del análisis cuantitativo de imágenes para determinar el ancho y la altura aparentes a lo largo de la trayectoria de la molécula.// CALIFICACION DEPARTAMENTO DE GRADUADOS Calificación de la defensa oral: 10 (diez) p. Fecha: 19/7/96
Tesis--Universidad Nacional del Sur, 1996.
Incluye referencias bibliográficas.
Keywords: Citologia; Biologia molecular; Microscopia