Identificación y caracterización de receptores de membrana para la hormona esteroidea 17 ß-estradiol - Monje, Paula. (2000)
Los estrógenos ejercen efectos rápidos de origen no-genómico en varios de sus tejidos target los cuales sugieren la existencia de receptores localizados en la membrana celular. En el marco de este concepto general iniciamos investigaciones tendientes en principio, a la búsqueda de un modelo experimental apropiado para la identificación de receptores de membrana para la hormono 17ß-estradiol. Posteriormente, los estudios fueron dirigidos hacia la caracteriazación molecular de estos receptores. Como resultado de nuestros primeros estudios de descripción bioquímica de receptores putativos de membrana, logramos identificar y caracterizar proteínas ligadoras de 17ß-estradiol asociadas a membranas celulares de tejido uterino de conejo. Usando [3H]17ß-estradiol como radioligando en estudios de ligado convencionales, detectamos la presencia de sitios de unión específica, saturables y de alta afinidad para el esteroide (Kd=0.36nM). La concentración de sitios ligadores en las fracciones de membranas, generalmente excedió la presente en las fracciones citosólicas respectivas. La unión de 17ßestradiol a las membranas resultó ser altamente específica, ya que otras hormonas de origen esteroidal evidenciaron ser muy poco potentes para competir por la unión del ligando marcado. El ligado se caracterizó además por ser específico de isómero, ya que ek estereoisómero natural 17a-estradiol demostró ser mucho menos eficaz en su capacidad para competir. La capacidad de desplazamiento obtenida para el 17a-estradiol, fue de aproximadamente dos órdenes de magnitud inferior en comparación con la de la hormona natural. Clásicos ligandos de los receptores estrogénicos conocidos fueron reconocidos con alta afinidad por los sitios de membrana, similarmente a lo que ocurre para los receptores citosólicos. Entre estos ligandos, el dietilestilbestro (DES), derivado no-esteroidal, y el compuesto ICI 182,780 demostraron competir casi tan efectivamente como la hormona natural. En concordancia con estos resultados, el antiestrógeno tamoxifeno, otro derivado de naturaleza no esteroidal, pudo ser eficientemente reconocido tanto por los sitios de membrana como por los citosólicos. Los sitios de unión presentes en las membranas fueron sensibles al tratamiento con tripsina, lo cual indica su origen proteico. Las proteínas ligadoras de membrana pudieron ser removidas en gran medida (80-90 ) tanto por tratamientos con buffers de alta / baja fuerza iónica, como por la acción de detergentes. Estos resultados sugieren que las proteínas ligadoras de 17ß-estradiol se asocian a las membranas por interacciones de tipo periférico, haciendo poco probable un origen integral. Para excluir la posibilidad de contaminación de las preparaciones de membrana con receptores citosólicos, se midió la actividad enzimática del marcador soluble glucosa-6-fosfato deshidrogenasa tanto en las membranas como en el citosol. Las preparaciones citosólicas constituyen la principal fuente de sitios ligadores de estrógenos al someter al tejido uterino a procedimientos clásicos de homogeneización y centrifugación diferencial. Los ensayos enimáticos evidenciaron ausencia de actividad del marcador citosólico en las fracciones de membrana, resultado que confirma el real origen particulado de los sitios detectados. Por ensayos de Western Blot, pudimos detectar una bja expresión de proteínas recptoras del peso molecular esperado (+67kDa) en las membranas uterinas. Estos resultados fueron confirmados mediante el empleo de anticuerpos dirigidos contra diferentes epitopes del receptor estrogénico convencional o ER a. Estos anticuerpos permitieron revelar en las membranas la presencia de adicionales bandas inmunoreactivas de bajo peso molecular. Curiosamente, estas proteínas de naturaleza no determinada estuvieron ausentes en los respectivos controles de citosol uterino, o bien se expresaron allí en muy baja proporción. Ésto marca un notable contraste con los perfiles de expresión de inmunoreactividad para ER a en las membranas. Una correlación indirecta entre la presencia de sitios ligadores de 17ß-estradiol y la expresión de inmunoreactivdad para ER a, surge de estudios de bloqueo en los que un anticuerpo monoclonal específico dirigido contra el dominio de ligado de la hormona del ER a, se usó como inhibidor del ligado de la hormona tritiada a las preparaciones microsomales. Sorprendentemente, pudimos verifcar que estos anticuerpos se comportaron como efectivos agentes bloqueantes del ligado de 17ß-estradiol radiactivo a membranas y citosol uterino. La capacidad de bloqueo en ambas fracciones resultó ser de aproximadamente un 50-60 del ligado específico total cuantificado. Sin embargo, se pudo registrar en forma constante una remanente actividad de ligado de [3H]17ß-estradiol que no pudo ser inhibida en las fracciones por la previa incubación con anticuerpos anti-ER a específicos. A través de estudios de Western Blot usando anticuerpos específicos dirigidos contra la recientemente descripta isoforma ER ß, pudimos demostrar la co-expresión de proteínas a y ß en las fracciones de membranas uterinas. <la expresión de esta novel isoforma de +45-50 kDa fu igualmente evaluada en tejido ovárico de conejo, por tratarse de un control positivo de expresión para las mismas. En tejido uterino, las bandas reactivas para ER ß se revelaron con alta intensidad en las fracciones de membranas, y su expresión fue cuantitativamente superior a aquella registrada en citosol. Las bandas inmunoreactivas de membrana relacionada con el ER a, no resultaron ser producto de reactividad cruzada de los anticuerpos anti-ER a con la nueva isoforma. En la línea de investigación que hemos iniciado acerca de macromoléculas ligadoras de 17ß-estradiol en tejido uterino, hemos detectado una distribución inesperada de significativas cantidades de sitios ligadores de la hormona asociados a fracciones mitocondriales del mismo origen. La existencia de estos sitios ha siso previa y tempranamente reportada en la literatura,no habiéndose determinado aún su naturaleza molecular.CALIFICACION DEPARTAMENTO DE GRADUADOS Calificación de la defensa oral: Sobresaliente - 10 (diez) Fecha: 9/4/01