El papel de los lípidos en la estructura y función del receptor de acetilcolina nicotínico
Las propiedades del receptor nicotínico colinérgico muscular (AChR) están reguladas por los lípidos de la membrana. Por tratarse de una proteína integral, desde su síntesis hasta su aparición en la sinapsis y posterior degradación, el AChR esta inmerso en una bicapa lipídica, cuya composición está p...
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| Formato: | Online |
| Idioma: | spa |
| Publicado: |
2009
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| Acceso en línea: | http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/1975 |
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| Sumario: | Las propiedades del receptor nicotínico colinérgico muscular (AChR) están reguladas por los lípidos de la membrana. Por tratarse de una proteína integral, desde su síntesis hasta su aparición en la sinapsis y posterior degradación, el AChR esta inmerso en una bicapa lipídica, cuya composición está pre-determinada y finamente controlada por la célula. Por lo tanto, el análisis funcional de la relación entre los lípidos y el AChR requiere de un sistema celular que funcione a modo de tubo de ensayo, para evitar los modelos artificiales puros con membranas reconstituídas. Con este propósito, generamos modelos celulares que expresan heteróloga y onstitutivamente el AChR y en los que se puede modificar parcial y selectivamente el contenido de ciertas especies lipídicas. En una primera etapa a través de la cotransfección del ADNc de las subunidades del AChR adulto de ratón en una línea celular con metabolismo lipídico normal, CHO-K1 (Forsayeth et al., 1990c), establecimos el sistema de referencia. Posteriormente, generamos dos modelos experimentales con líneas celulares mutantes que eran deficientes en el metabolismo lipídico: una línea mutante de CHO-K1, denominada SPB-1deficiente en esfigomielina (SM) (Hanada et al., 1990) y otra línea derivada de CHO-K1, auxotrófica, llamada PSA-3, deficiente en fosfatidilserina (PS). Obtuvimos la estirpe SPB-1/SPH que expresa el AChR y modula, por efecto de la temperatura, la actividad de la enzima serina palmitoil transferasa (SPT), clave en la vía de síntesis de los esfingolípidos. A temperaturas de cultivo entre 33 C y 37 C la actividad de la enzima representa sólo del 4 al 8% de la actividad normal, lo cual disminuye los niveles celulares de SM y gangliósidos como el GM3 a valores menores del 1%. Con este modelo, determinamos que no existen diferencias en los parámetros electrofisiológicos y en las propiedades farmacológicas del receptor, y caracterizamos la participación activa de la SM en los mecanismos que regulan el tráfico exocítico de la proteína a la membrana plasmática. También generamos la línea clonal PSA/AChR, que expresa el AChR y no es capaz de realizar normalmente la síntesis de PS por tener alterada una de las enzimas que catalizan su síntesis. Por este motivo, requiere del agregado exógeno del fosfolípido para su normal crecimiento. Transfectadas las células y seleccionados los clones positivos, analizamos el ARN por RT-PCR para determinar la expresión de las subunidades. Con los clones elegidos realizamos ensayos de unión a [125I]α-bungarotoxina, un radioligando específico para AChR, determinándose los parámetros cinéticos y farmacológicos. Los parámetros electrofisiológicos del canal se caracterizaron por la técnica de patch-clamp y el análisis topológico de la expresión por microscopía de fluorescencia. De esta manera, en cada modelo celular caracterizamos las diferencias estructurales y topológicas del AChR causadas por las variaciones en el contenido lipídico. En el segundo capítulo de esta tesis analizamos el rol que poseen los aminoácidos que están ubicados, de cara a la membrana, en contacto directo con los lípidos. Con este propósito, modificamos la estructura primaria de la proteína por medio de mutaciones simples y dobles, en residuos cargados y muy conservados, situados en los extremos del segmento M4 a la altura de las cabezas polares de los fosfolípidos. Por co-transfección de una subunidad mutada con el resto de las subunidades en la versión salvaje, generamos cinco líneas clonales mutantes. En estos modelos se realizaron ensayos farmacológicos con [125I]-BTX, microscopía de fluorescencia y técnicas bioquímicas que nos permitieron determinar la magnitud de la expresión del receptor mutado y los cambios estructurales y funcionales que se produjeron cuando los diferentes residuos del AChR fueron mutados. |
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