Receptores cys-loop : mecanismos moleculares de activación y modulación por fármacos neuroactivos
Los receptores cys-loop pertenecen a la familia de canales iónicos pentaméricos activados por ligandos (pLGICs). Se expresan ampliamente en el sistema nervioso, donde ejercen un rol vital en la comunicación neuronal. Están involucrados en los procesos de aprendizaje, memoria, movimiento, entre otros...
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| Formato: | Online |
| Idioma: | spa |
| Publicado: |
2014
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| Acceso en línea: | http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/525 |
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| Sumario: | Los receptores cys-loop pertenecen a la familia de canales iónicos pentaméricos activados por ligandos (pLGICs). Se expresan ampliamente en el sistema nervioso, donde ejercen un rol vital en la comunicación neuronal. Están involucrados en los procesos de aprendizaje, memoria, movimiento, entre otros. Se han asociado alteraciones en la funcionalidad de estos receptores con una gran variedad de desórdenes neurológicos, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, síndromes miasténicos, esquizofrenia y depresión. Por ello, los receptores cys-loop son importantes blancos farmacológicos. En consecuencia, consideramos que el conocimiento de los mecanismos moleculares que conducen a su activación y disfunción es de suma relevancia. Los receptores Cys-loop están formados por un dominio extracelular, que contiene los sitios de unión de agonista, y un dominio transmembrana, que forma el poro iónico. La interfase entre ambos dominios, llamada región de acoplamiento, desempeña un rol clave en la propagación de los cambios conformacionales que se inician con la unión del agonista en la región extracelular y culminan con la apertura del poro iónico a nivel transmembranal. En este trabajo de Tesis Doctoral estudiamos dos regiones claves en el proceso de activación de los receptores Cys-loop: el sitio de unión de agonista, donde comienza la respuesta, y la interfase entre los dominios extracelular y transmembrana o región de acoplamiento. Utilizamos receptores homopentaméricos que por estar compuestos por cinco subunidades iguales, poseen cinco sitios de unión de agonista y cinco regiones de acoplamiento idénticas. Los receptores homoméricos surgieron más tempranamente en la escala evolutiva por lo que presentan características estructurales y funcionales comunes a todos los miembros Cys-loop, y son, por lo tanto, modelos útiles para el estudio de los receptores de esta familia. En el Capítulo I de esta Tesis determinamos el número de regiones de acoplamiento necesario para la activación de los receptores Cys-loop y su relación con los sitios de unión de agonista. Para ello, utilizamos como modelo de receptor homopentamérico al receptor quimérico a7-5HT3A, compuesto por secuencias del receptor a7 en su dominio extracelular y secuencias del receptor 5-HT3A en su dominio transmembrana, el que ha sido ampliamente utilizado como modelo de a7. Para conocer la contribución de cada una de las cinco regiones de acoplamiento a la estabilidad de canal abierto del receptor a7-5HT3A, empleamos nuestra estrategia experimental denominada electrical fingerprinting. Según esta estrategia, co-transfectamos células con una subunidad conteniendo la región de acoplamiento activa y otra subunidad conteniendo la región de acoplamiento inactiva, una de ellas conteniendo además mutaciones reporteras de conductancia. De esta forma, logramos expresar en membrana receptores con distinto número de regiones de acoplamiento funcionales que son identificados mediante registros de patch-clamp de canal único. Gracias a la presencia de las mutaciones reporteras de conductancia, la medición de la amplitud de cada apertura nos permitió conocer la estequiometria del receptor, es decir, el número de subunidades con región de acoplamiento funcional que tiene el receptor pentamérico que dio origen a esa apertura. Determinamos la duración de los eventos de apertura provenientes de receptores con distinto número de regiones de acoplamiento funcionales, que constituye una medida de la estabilidad de canal abierto. Encontramos que cada región de acoplamiento contribuye en forma independiente y simétrica a la estabilidad del canal abierto y que son necesarias las cinco regiones de acoplamiento funcionales para lograr la óptima activación del receptor. Demostramos además que la presencia de una sola región de acoplamiento funcional en el pentámero es suficiente para lograr la activación pero no permite mantener el canal abierto en su tiempo óptimo. Además generamos receptores a7-5HT3A mutantes, que contenían distinto número de sitios de unión de agonista y regiones de acoplamiento funcionales. Esta estrategia nos permitió establecer los requisitos estructurales mínimos que logran la activación del receptor, así como también los requerimientos estructurales que conducen a la máxima estabilidad del estado abierto. Encontramos que el receptor es capaz de responder al agonista mediante la ocupación de un único sitio si este se encuentra formado por dos subunidades con regiones de acoplamiento funcionales. Sin embargo, para lograr la óptima activación y duración máxima del canal abierto, el receptor modelo utilizado requiere de tres sitios de unión de agonista funcionales y sus cinco regiones de acoplamiento intactas. En el Capítulo II, estudiamos la activación del receptor neuronal a7 en condiciones de sub-ocupación de sus cinco sitios de unión de agonista. Este receptor se localiza principalmente en sitios distantes a los sitios de síntesis y liberación de acetilcolina (ACh), por lo que la ACh, o su producto colina, deben difundir y unirse a receptores a7 distantes. Este mecanismo colinérgico no sináptico predice que el grado de ocupación de los receptores a7 sería bajo en condiciones fisiológicas. Para estudiar la activación del receptor a7 en condiciones de sub-ocupación de sus sitios de agonista, realizamos ensayos electrofisiológicos y medimos la duración del canal abierto de receptores individuales que presentan un único sitio de unión de agonista funcional, y la comparamos con la de receptores que tienen sus cinco sitios funcionales. Para conocer el número de sitios de unión de agonista funcionales empleamos nuevamente la estrategia electrical fingerprinting. Esta estrategia requiere la medición exacta de la amplitud. Teniendo en cuenta que los receptores a7 presentan aperturas de duración breve que no permiten la resolución de su máxima amplitud, los estudios electrofisiológicos se realizaron sobre receptores a7 mutados o en presencia de potenciadores que aumentan la duración del canal abierto. En este trabajo, demostramos que la estabilidad del canal abierto de receptores a7 que presentan un único sitio de unión de agonista funcional es la misma que la de los receptores que presentan sus cinco sitios disponibles. Por otro lado, cuando reemplazamos el dominio transmembrana del receptor a7 por el del receptor 5-HT3A, encontramos que la duración del canal abierto se incrementa al aumentar el número de sitios ocupados por agonista. Este resultado demuestra por primera vez que el dominio extracelular no es el único determinante de la relación entre ocupación y estabilidad del canal abierto. Por lo tanto, en este trabajo demostramos la capacidad del receptor a7 de activarse y producir respuestas máximas con la ocupación de un solo sitio de unión de agonista, propiedad que es única y exclusiva de este receptor dentro de todos los miembros de la familia de receptores Cys-loop. Este resultado posee además relevancia fisiológica dado que esta propiedad le permitiría al receptor adaptarse al mecanismo de transmisión no sináptico. En su conjunto, los resultados que surgen de esta Tesis revelan una novedosa relación funcional entre dos dominios estructurales de estos receptores, el sitio de unión de agonista y la región de acoplamiento, y, además, contribuyen al conocimiento general del mecanismo de activación de los receptores de la familia Cys-loop. |
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