Fosfolipasas D y A2 : nuevos mecanismos de respuesta al estrés oxidativo asociado con la enfermedad de Parkinson
La enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno neurodegenerativo más común en la población mundial. Esta patología es causada principalmente por la degeneración y muerte progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra pars compacta (SNpc). La señalización celular en la EP h...
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| Formato: | Online |
| Idioma: | spa |
| Publicado: |
2021
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| Acceso en línea: | http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/5586 |
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| Sumario: | La enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno neurodegenerativo más común en la población mundial. Esta patología es causada principalmente por la degeneración y muerte progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra pars compacta (SNpc). La señalización celular en la EP ha sido y es uno de los aspectos más estudiados de la enfermedad, para tratar de comprender su etiopatogenia y encontrar nuevas dianas terapéuticas que permitan un tratamiento más específico de la enfermedad. Un componente clave en la muerte de las neuronas dopaminérgicas es el estrés oxidativo (EO), sin embargo, poco se sabe sobre el papel que juega la señalización mediada por las fosfolipasas D y A2 (PLD y PLA2, respectivamente) en este evento que inicia en etapas tempranas de la EP. El objetivo de este trabajo de tesis fue caracterizar el rol que cumplen las isoformas más importantes y estudiadas de las enzimas PLD y PLA2 en la respuesta neuronal frente al daño oxidativo. Para esto, se utilizaron como estímulo la 6-hidroxidopamina (6-OHDA) y la sobrecarga de hierro (Fe), dos agentes neurotóxicos ampliamente utilizados en el estudio de esta patología. La exposición neuronal a la 6-OHDA, un análogo hidroxilado de la dopamina, constituye una estrategia útil para estudiar los eventos moleculares asociados con la muerte neuronal en la EP. La 6-OHDA aumenta los niveles de oxidantes celulares y deteriora la cadena respiratoria mitocondrial, promoviendo así la lesión neuronal y la muerte. A pesar del uso extensivo de 6-OHDA en modelos animales, los eventos moleculares precisos desencadenados por este neurotóxico a nivel neuronal aún no se han dilucidado completamente. Las células de neuroblastoma humano IMR-32 expuestas a concentraciones crecientes de 6-OHDA mostraron altos niveles de especies reactivas de oxígeno (EROs) y aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática con disminución concomitante de la viabilidad celular. Como parte de la respuesta neuronal a la exposición a 6-OHDA, se observó la translocación de la subunidad p65 del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-κB) hacia el núcleo. La localización nuclear de NF-κB también fue acompañada por un aumento de la fosforilación del inhibidor de kappa B (IκB), así como por un aumento en los niveles de ARNm de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y el receptor 4 de prostaglandina E2 (RP4). Aunque las vías canónicas que participan en la modulación de NF-κB se han descrito ampliamente, aquí se trabajó con la hipótesis de que la lesión inducida por 6-OHDA puede activar las vías de señalización de lípidos y, a su vez, modular la respuesta transcripcional. El EO generado en la célula por la 6-OHDA desencadenó la activación de vías de señalización de lípidos y produjo un aumento de los niveles de ácido fosfatídico (PA), diacilglicerol (DAG) y ácidos grasos libres en las células de neuroblastoma humano. La inhibición de la producción de PA pudo prevenir la disminución de la viabilidad celular provocada por 6-OHDA, la translocación nuclear de la subunidad p65 de NF-κB y el aumento en la expresión del ARNm de COX-2. En el primer capítulo de esta tesis, nuestros resultados indican que la respuesta neuronal desencadenada por 6-OHDA implica la activación de vías de señalización mediadas por PA que, a su vez, gobiernan la localización subcelular de NF-κB y la expresión de COX-2 de manera diferencial. La acumulación de Fe y la sobre-expresión de α-sinucleína son rasgos característicos de varios trastornos neurodegenerativos. Previamente en nuestro laboratorio hemos demostrado que el EO inducido por Fe activa la liberación de ácidos grasos catalizada por diferentes isoformas de PLA2 en el sistema nervioso. En este trabajo, nuestro objetivo fue estudiar la participación de las PLA2 en la regulación de la biología de la α-sinucleína y en la respuesta neuronal a la sobrecarga de Fe. También investigamos el papel de los factores secretados por la glía en la resolución del daño oxidativo por parte de las neuronas. Se estudió el estado redox, la fosforilación de α-sinucleína y la participación de las isoformas de PLA2 citosólica e independiente de calcio (cPLA2 e iPLA2, respectivamente) en la regulación de estos eventos. Las neuronas IMR-32 expuestas a una sobrecarga de Fe, bajo la forma del compuesto denominado citrato amonio férrico (FAC), mostraron un aumento de los niveles de expresión de iPLA2, concomitantemente con un aumento de los peróxidos lipídicos y las EROs. El bloqueo farmacológico de la actividad de iPLA2 aumentó, aún más, los niveles de peróxidos lipídicos y el contenido de EROs. Por el contrario, la inhibición conjunta de cPLA2 e iPLA2 mostró el efecto opuesto al promover una disminución de los marcadores de EO asociados con una mayor viabilidad neuronal. Las neuronas estimuladas con Fe también mostraron un aumento de la fosforilación de α-sinucleína. La fosforilación de α-sinucleína fue bloqueada por la inhibición de la actividad de la iPLA2. Gran parte de estos resultados también fueron corroborados por estudios en la línea celular de neuronas dopaminérgicas de rata (N27). Para estudiar el papel de la glía en la respuesta neuronal al Fe, se expusieron las células de astroglioma C6 a FAC o su vehículo, y los medios derivados de los astrocitos incubados en estas condiciones se añadieron, luego, a cultivos neuronales. En la caracterización de los astrocitos expuestos a Fe, estos mostraron un aumento en el marcador glial S100β y en los niveles de peroxidación lipídica, indicando una reactividad al EO. Los astrocitos fueron positivos para γ-glutamilcisteína ligasa, enzima limitante de la reacción de biosíntesis de glutatión. La respuesta de las neuronas a los medios condicionados de los astrocitos fue diferente dependiendo del origen de la línea celular. Mientras que el medio condicionado de astrocitos demostró ser neuroprotector para las neuronas humanas IMR-32, el efecto contrario se observó en las células dopaminergicas N27 derivadas de mesencéfalo de rata. Los resultados del segundo capítulo de esta tesis muestran roles específicos para la iPLA2 en cuanto a la neuroprotección y modulación de la fosforilacion de α-sinucleína en la respuesta neuronal a la lesión inducida por Fe. En conjunto los hallazgos de este trabajo de tesis contribuyen a dilucidar nuevos mecanismos de acción de determinadas isoformas de la PLA2 y la PLD en procesos de injuria neuronal asociados con la EP. |
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